北伐军占领武汉后，由于当时全国革命的重心，已经转移到长江流域，为了适应形势的需要，国民党中央和国民政府决定迁都武汉，于1927年1月正式在武汉办公。然而，蒋介石却坚决反对迁都武汉，竭立主张迁都南昌。他的理由是政治应与军事配合，党政中央应与总司令部在一起，而总司令应设在前线南昌。实际上蒋介石是企图把党政军控制在他一个人手里。当时，武汉的共产党人、国民党左派和人民群众对蒋介石的这种企图，进行了坚决的抵制。使蒋介石未能得逞。蒋介石在《苏俄在中国》一书中回顾这段历史说：
十一月，本党中央常务委员会及国民政府委员，到南昌
集会，决定中央机关暂驻南昌，主持激定东南的军政大计。
但是十二月十三日，鲍罗廷竟在武汉集合一部分中央委员和
国府委员会开会，决定组织所谓‘联席会议’，推徐谦为主席，
执行其所谓‘党的最高职权’。这显然是莫斯科指使下对党
的分裂行动，我为了保持本党的团结和军事的统一，不能不
极力容忍。十二月十九日及二十日，我两电武汉，对于武汉
联席会议的决议案，皆表同意，并且敦劝当时留驻南昌的中
央委员和国府委员，迂移武汉，使三中全会得以举行。
而事实上，蒋介石的行为只是一种被迫的举动。当1926年11月北伐军攻克南昌后的当月初，宋庆龄、徐谦、陈友仁、吴玉章。王法勤、鲍罗廷等十多人到了南昌，蒋介石亲自接待。7日在庐山开会时，没有议出任何具体方案，大家就下山回武汉去了。这些人一走，对蒋介石企图迁都南昌是一个打击。12月13日国民党中央执行委员和国民政府委员在武昌开会决议组织“联席会议”，在政府未正式迁来武汉之前，执行最高职权。1927年1月1日，武汉宣布国民党中央和国民政府已在武汉执行职务，而蒋介石却在1926年12月31日在南昌宣称国民党中央党部及国民政府已迁至南昌。1927年1月3日，武汉政府举行国民政府北迁和北伐胜利的庆祝大会，同日，蒋介石致电武汉称，根据南昌国民党中央政治会议决定，以及北伐军发展情况，主张国民政府暂设南昌。武汉复电不表赞同，于是蒋介石亲自到武汉，想说服武汉的国民党人。对此，李宗仁在回忆中说：“民国十六年一月中旬，蒋总司令曾亲赴武汉视察，渠见武汉风色不对，恐发生意外，稍留即去。”
当时的“风色”确实不利于蒋介石。蒋介石后来说：“1927年1月n日，他到武汉时，鲍罗廷当面对他说：“蒋介石同志，我们三年以来，共事在患难之中，所做的事情，你应该晓得，如果有压迫农工、反对C·P·的这种事情，我们无论如何要想法子来打倒的。”由于迁都武汉是大势所趋、人心所向，蒋介石也只得表示拥护。1927年2月20日和3月5日，他在南昌先后两次在欢送中央党部国民政府迁鄂的大会上发表演讲，说：“武汉是全国的中心，也是政治变迁的策源地。我们党部和政府到了武汉，一定比在南昌发展得更快。我们今天可以代表在南昌的同志，明白的告诉谭主席和各位委员：我们的政府虽然迁都武汉去了，我们在南昌的同志，对于拥护政府、拥护本党的热忱，比现在还要增加几倍。”
蒋介石的两面派手法，在这一时期被他发挥得淋漓尽致。早在1月u日，他在武汉参加群众大会时，就有人当众质问蒋介石为什么违抗国民党中央迁都武汉的决定。其后，鲍罗廷的讲话又更深地刺激了他，以致他恼羞成怒，跑回南昌，于1月19日给武汉联席会议主席徐谦发了一份电报，说鲍罗廷当众侮辱了他，要求撤销鲍罗廷的顾问职务，并再一次重申了迁都南昌的要求。
徐谦见到这个电报，深恐大敌当前先起内江，于是又在2月初举行会议。会上，中共人士及国民党左派对蒋介石“迁都逐鲍”的主张给予坚决回绝，蒋介石迫于压力，又不敢在这时公然叛变革命，所以，才不得不于2月8日在南昌作出了“中央党部及国民政府迁到武汉”的决定。
蒋介石表面上服从了会议决定，放弃了迁都南昌的主张，这只不过是他的缓兵之计。‘他一方面做了一副服从党中央的老实相，发表“拥护政府，拥护党”的演讲，一方面却加紧向国民政府占领的省份委派自己的亲信去做党的特派员，掌握基层的党权。同时，他制造各种借口，压迫农会，解散农民自卫军，排斥共产党人和国民党左派。在军事上，他调集部队，摆出向南京、上海进攻的态势，准备攻下东南沿海一带民丰物阜的地方，以期获得江浙财团的支持。
与此同时，蒋介石又公开表示要求得到英、美等帝国主义国家的援助。1927年初，各帝国主义买办、北洋军阀的政客云集南昌，进行所谓的“政治南伐”。蒋介石的把兄弟张群、黄郭等也混迹其中，张群还被蒋介石任命为总司令部总参议。英、美在上海的买办代表人物虞洽卿也亲赴南昌游说，以同意增加关税、从财政上支持蒋介石为诱饵，条件是取消“打倒帝国主义”这一北伐口号。在帝国主义和买办阶级的支持下，蒋介石叛心陡生，胆子也大了。
1927年2月21日，蒋介石在南昌总部第十四次总理纪念周上发表了长篇演讲。他说：“现在武汉的本党一部分同志，有一种运动，有一种宣传，所谓要提高党权。集中党权。……今日提出这集中党权、提高党权的口号，不过拿一个口号来排除异己的同志，做他们真正要想把持党权的武器就是了。”进而他更露骨地说：“现在共产党党员，事实上有许多对国民党党员加一种压迫，表示一种强横的态度，并且有排挤国民党员的趋向，使得国民党党员难堪。这样，我更不能照从前一样的对待共产党员了。”他还说：“我亦曾附带的有一句话，就是说：‘将来共产党强大起来了，如共产党员有跋扈强横的事实发生，那我一定要训正他们，并且一定要制裁他们，也要以今日对待本党同志的态度来对待他们。”’《向导》当时发表文章评论了蒋介石的这次讲话是：“特别是看重共产派，差不多演说中十分之六七是对共产派说话的，说共产党员如何强横，他要如何制裁共产党。”蒋介石的这次演讲发表以后，南京、上海的帝国主义国家在华的通讯社和报纸如东方社、通电社、路透社、匝天时报、宇林西报等，都大吹特吹，语句之间都表现一种极兴奋的样子，差不多异口同声地说：“蒋介石已起来反对左派，抑制共产派了。”孙传芳、张宗昌在上海办的《新申报》和西山会议派在上海办的《江南晚报》，也先后发表社论，登出蒋介石的演讲，并大加赞扬说：“到底蒋介石不错，还能起来抑制共产分子。”3月7日，蒋介石又借南昌总部第十六次总理纪念周之机，再次发表长篇演讲，痛骂武汉政府对他反共反人民的行为的制裁是：拿一种压迫的手段对待本党的领袖，或有侮辱我们本党的行动”，是反对革命领袖，破坏国民革命，”而且说：“如果有反宣传，阻碍我们的革命，那我们就要当作他是反动派，当作他是我们的敌人看待。”蒋介石还说：“若苏俄一旦不以平等待我，像别的帝国主义一样压迫我们的时候，我们也是像反对帝国主义一样的反对他们。”不言而喻，这里的客观标准就是对蒋介石的态度，拥蒋者即为“平等待我”，反蒋者即为“不以平等待我”。这种言论同西山会议派当时反对联俄和论调一模一样。西山会议派的上海大会宣言就是这样说的：“吾人尝以‘平等待我’为民族间之量尺矣，凡言行一致，合乎此量尺者皆吾友，否则不惟非友，甚至为仇”。
蒋介石在南昌发表上述反共反人民言论的同时，也在暗中加紧与帝国主义进行联络。早在1926年底，日本国即已派佐分利贞男（日本外务省条约局局长）前往汉口、南昌分别会晤了陈友仁和蒋介石。
1927年1月8日，佐分利贞男向日本外相报告：在南昌的蒋介石派与武汉的共产派之间“存在着尖锐的对立”。l月底，日本驻九江领事江户在庐山会晤蒋介石，电告外相说：蒋介石谈话明确表示，他非但不废除不平等条约而且将尽可能尊重它们；保证承认外国借款，并如期偿还；外国投资的企业将受到充分的保护。同时，蒋介石又秘密地派戴季陶赴日本，向日本当局要求援助，其交换条件是答应镇压上海工人罢工。
蒋介石说一套，做一套，明一套，暗一套的两面派手法引起了国民党左派和中共的高度警惕。为了反对蒋介石的军事独裁，防止他叛变革命，国民党左派于2月9日举行高级干部会议，推举吴玉章、邓演达、徐谦、孙科。顾孟余5人组成“行动委员会”作为 专门同蒋介石的军事专制独裁做斗争的领导机关。会议针对蒋 介石的独裁，发表了宣言，指出：“巩固党的权威一切权力属 于党是目前党的第一标准”，主张“军队在党的指挥下统一起来，并准备与某系武装决斗！”
在“行动委员会”领导下，共产党人和国民党左派在全国范围 内发动了实行民主、反对独裁、提高党权、扶助工农的运动，同时发动了“欢迎汪精卫回国复职”运动。对此，蒋介石深感恐慌，曾先后两次派人到上海与中共中央谈判，并以最后通碟式的态度要求停止迎接汪精卫回国复职的运动。但谈判和恐吓都没起作用，汪精卫终于回国了。
汪回国后，国民党中央决定1927年3月7日在武汉召开国民党二届三中全会。各地中央委员陆续抵汉，只有蒋介石和留在南昌的中央委员们迟迟不来。会期临近，国民党中央主席张人杰拒绝参加大会，到上海去了。而蒋介石则主张要把会期改为3月12日他才能到会。这是明目张胆地蔑视中央的一种挑衅，遭到了大多数中央委员的激烈反对。但因为少数人有顾虑，同时也为了进一步争取团结蒋介石，决定把3月7日如期召开的会议算作预备会，3月10日再正式开会，以便等待蒋介石赴会。但蒋介石却始终未来出席会议。
3月10日，国民党二届三中全会正式召开。会议通过了“统一党的领导机关案”，规定全国代表大会为党的最高权力机关，大会闭幕期间，由中央执行委员会行使最高权力。常委会不设主席，由9人组成常委会主席团，对党务、政务、军事行使最终议决权。这个新规定，实际上等于撤销了蒋介石在党内的领导权。
会议还规定“军事委员会为国民政府最高军事行政机关”，军事委员会也不设主席，而由7人组成军事委员会主席团，“主席团之议决及发布命令，须有主席团委员四人签字方生效力”，“总司令是军事委员会委员之一”；军官任免和出征动员，须经军委会议决议，提交中央执行委员会通过，方可交总司令部执行。这些规定，大大缩小了蒋介石在军事指挥上的权力，实际上等于把这位总司令降职为一个“传令兵”。
会议还通过了“对全体党员的训冲案”，针对蒋介石的独裁行径着重指出：“自北伐军兴，军事政治党务集中个人，愈使政治之设施，不能受党的领导，而只受军事机关之支配。此种制度，为害甚多”。所以“决定将一切政治、军事、外交、财政等大权均集中于党”。
这实际上等于把蒋介石自北伐开始后所取得的党政军大权悉数剥夺了，只给他留了个“总司令”的虚名。前文曾提及蒋介石于盛怒之下寻枪自杀未遂一节，就是在他听到上述决议后发生的。
在蒋介石的心目中，南京才是日后的国民党中央以及国民政府的所在地，他之主张迁都南昌，不过是为了进一步控制党政大权。誓师北代以后，蒋介石制下的军队迅速扩张。北伐出师前，蒋介石的嫡系只有6个师，北伐部队8个军中，他只有一个军。但当北伐军打到南昌时，国民革命军已经发展到40个军，其中大部分是蒋介石一手收编的军阀部队。蒋介石以高官厚禄收买了不少旧军阀，使他们忠实于自己。军事实力的迅速扩张，也膨胀了他的野心，所以他拥兵自重，独断专行，对武汉方面的决议嗤之以鼻，他认定：没有他的参与，是不可能组织一个合法政府的。何况自从孙中山逝世后，蒋介石一直认为自己是孙中山的惟一的真正的继承人。因此，他视武汉政府为“伪政府”表面上虚以委蛇，暗地里却包藏祸心。他调动军队，加强九江、南昌的防御，以应付 武汉方面可能的军事突袭。他紧张地忙了大约一个星期，却不见 武汉方面有什么军事行动，遂更坚定了他的决心：表面上听命于武汉，暗中积蓄力�